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Presens傳感器插頭在微流體中的應(yīng)用
在這項研究中，我們假設(shè)傳感器系統(tǒng)可用于小膠質(zhì)細胞代謝的無創(chuàng)實時監(jiān)測，以進一步闡明動態(tài)微環(huán)境下特定表型的極化水平。我們設(shè)計并制造了一種微流控芯片，用于在連續(xù)流動下培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞，并將氧氣和 pH 值的變化與激活后的極化狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
炎癥是由外來抗原、病原體和化學物質(zhì)等刺激引發(fā)的一系列復雜事件。它在多種疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如自身免疫性疾病、癌癥和傷口愈合過程 [1]。巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞由于其抗原呈遞、吞噬作用和免疫調(diào)節(jié)特性而分別在炎癥和神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用 [2]。小膠質(zhì)細胞作為巨噬細胞的一種亞型，在神經(jīng)免疫反應(yīng)中也像巨噬細胞一樣發(fā)揮作用 [3]。根據(jù)它們在生理微環(huán)境中暴露的信號，小膠質(zhì)細胞可以轉(zhuǎn)化為兩種不同的表型，稱為 M1 和 M2 [4]。也稱為“經(jīng)典激活”的促炎 M1 小膠質(zhì)細胞可以由脂多糖 (LPS) 誘導，而 IL-4 和 IL-13 誘導“交替激活”抗炎 M2 表型 [5,6]。為了響應(yīng)對 M1 表型的刺激，已顯示巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞中發(fā)生代謝變化。在 LPS 刺激期間，產(chǎn)生的一氧化氮 (NO) 會抑制氧化磷酸化，從而導致細胞轉(zhuǎn)為糖酵解。由于這種反應(yīng)，乳酸產(chǎn)量增加，這反過來又增加了細胞外酸化率 (ECAR)。監(jiān)測 pH 值的變化可以深入了解細胞和組織的生理和代謝狀態(tài) [7]。小膠質(zhì)細胞的極化狀態(tài)通?？梢酝ㄟ^基因表達、細胞表面標志物和釋放到培養(yǎng)基中或在細胞外基質(zhì)中積累的蛋白質(zhì)來檢測。在這方面PCR、流式細胞儀、ELISA 和 Western Blotting 是尤為常見的方法之一，它們具有侵入性、費力且耗時。這些技術(shù)也不能提供關(guān)于極化狀態(tài)變化的洞察力和實時監(jiān)測。體外 實驗。微流控芯片上的器官系統(tǒng)通過為異質(zhì)細胞群提供具有動態(tài)培養(yǎng)模型的 3D 分層架構(gòu)，提供了出色的體外 平臺來模擬復雜的器官/組織。先前已經(jīng)報道了具有復雜病因的疾病的神經(jīng)炎癥模型，這進一步突出了生物工程微環(huán)境的優(yōu)勢[8]。
材料與方法
微流控芯片由聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 制成，因為它具有柔韌性，便于插入傳感器插頭和密封泄漏。為了制造芯片的 PDMS 組件，PDMS 分別用 1:10 的固化劑和 PDMS 混合物澆鑄在聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 模具上。在真空下脫氣后，將模具在 80 ºC 下烘烤一小時，然后從模具中切出碎片。芯片 A 是一種混合芯片，包括 PMMA 和 PDMS 組件。芯片的底部包含一個用于 3D 培養(yǎng)和流體流動的通道，在這些層上帶有一個 PDMS 層，帶有入口、出口和傳感器插頭端口。有一個額外的 PMMA 層包圍了芯片，為光纜提供結(jié)構(gòu)支撐，從而促進螺栓的壓縮。所有這些層都在 6 個螺栓的幫助下結(jié)合在一起（圖 1C）。芯片 B 有兩層。在軟光刻之后，將制造的 PDMS 組件等離子結(jié)合到顯微鏡載玻片上。鍵合后，將這些芯片放置在 120°C 的熱板上 2 小時以增強鍵合強度。
圖 1：用于 3D 和 2D 小膠質(zhì)細胞極化的兩種不同制造的微流控芯片的圖像。用于 3D 細胞培養(yǎng)的芯片 A 的設(shè)計：A) AutoCAD 圖紙，尺寸以 [mm] 為單位，B) 芯片 A 從上到下的層數(shù)，C) 帶有藍色染料和傳感器插頭假人的芯片 A 的圖像，芯片 B 的設(shè)計用于2D 細胞培養(yǎng)：D) 芯片 B 的尺寸，E) 芯片 B 的層數(shù)，F(xiàn)) 帶有紅色染料和傳感器插頭假人的芯片 B 的圖像。 N9小鼠小膠質(zhì)細胞系用于巨噬細胞極化實驗。使用* RPMI（無酚）培養(yǎng)基 1640（補充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素/鏈霉素 (Pen/Strep)）進行細胞擴增。將細胞培養(yǎng)至 80% 融合并用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 收獲。用高細胞密度 (4.5 x 10 5細胞/cm 2 )接種乙醇滅菌的芯片，并在靜態(tài)條件下在 37 °C 和 5% CO 2下孵育過夜。
一旦小膠質(zhì)細胞粘附并形成單層培養(yǎng)物，就使用注射泵（哈佛儀器）以 0.5 µl/min 的連續(xù)流量進行管理（圖 2）。用 300 ng/ml 脂多糖 (LPS) 將小膠質(zhì)細胞極化為 M1 樣表型 24 小時。在整個研究過程中，未刺激的細胞用作對照組。將微流控芯片放置在細胞培養(yǎng)箱中，并將傳感器插頭連接到光纖電纜。收集氧氣和 pH 傳感器測量值 24 小時。在數(shù)據(jù)采集過程中，沒有打開培養(yǎng)箱以避免任何氣體和溫度波動。
圖 2：實驗裝置：A) 連接到光纖儀表和計算機的傳感器圖像，B) 注射泵和芯片的圖像，C) 培養(yǎng)箱內(nèi)的芯片和連接的光纜。
圖 2：實驗裝置：A) 連接到光纖儀表和計算機的傳感器圖像，B) 注射泵和芯片的圖像，C) 培養(yǎng)箱內(nèi)的芯片和連接的光纜。
在微流控芯片中動態(tài)培養(yǎng) 24 小時后，將含有 15 µM 二硫蘇糖醇 (DTT) 的裂解緩沖液移液到通道中以裂解細胞。收集裂解物并儲存在-80°C 用于 RNA 分離。使用 Macherey-Nagel RNA 分離試劑盒分離 RNA。通過 qPCR 分析根據(jù)其 TNFα、IL-6 和 iNOS 基因表達水平比較對照組和 M1 組。
在 24 小時孵育期間從微流控芯片出口收集的上清液用于 ELISA。Affymetrix eBioscience 小鼠 TNFα 試劑盒已根據(jù)制造商說明使用。為了驗證我們的傳感器讀數(shù)并確認 M1 極化，我們確定了對照組和 M1 組釋放的 TNFα 水平。
結(jié)果
溶解氧顯示 LPS 刺激的小膠質(zhì)細胞和未刺激的對照組減少。雖然在兩種情況下都有類似的趨勢，但在 24 小時的刺激期間，M1 極化小膠質(zhì)細胞的氧水平低于對照。對于 LPS 刺激的細胞，對照的溶解氧水平降低了 22.2% 和 29.5%（圖 3A）。在 pH 監(jiān)測芯片中，pH 水平在 24 小時內(nèi)下降，其中對照的最終值為 6.8，LPS 刺激細胞的最終值為 6.5。
圖 3：24小時刺激期間O 2和 pH 曲線的傳感器數(shù)據(jù)。A) 對照和 LPS 刺激細胞的 O 2 % 變化，B) 對照和 LPS 刺激細胞的 pH 變化。
在 24 小時結(jié)束時對 TNFα、IL-6 和 iNOS 的基因表達分析顯示了顯著的倍數(shù)變化，證實了動態(tài)微流體培養(yǎng)下 LPS 刺激的小膠質(zhì)細胞的 M1 極化。ELISA 測定表明從 LPS 刺激的細胞 (M1) 釋放的 TNFα 細胞因子顯著增加。在動態(tài)條件下 24 小時后的 TNFα 濃度測量為未刺激的對照為 102 pg/ml，LPS 刺激的小膠質(zhì)細胞為 470 pg/ml。
圖 4：對照和 LPS 刺激細胞的 mRNA 表達。A) 對照和 LPS 刺激細胞的 TNFα mRNA 表達，B) 對照和 LPS 刺激細胞的 IL-6 mRNA 表達，C) 對照和 LPS 刺激細胞的 iNOS mRNA 表達。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。P 值是從雙尾學生 t 檢驗計算的。
圖 5：從對照和 LPS 刺激的芯片出口收集的培養(yǎng)基的 TNFα 濃度水平 (pg/ml)。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。P 值是從雙尾學生 t 檢驗計算的。
討論
本研究的最初目的是觀察 3D 培養(yǎng)中極化過程中小膠質(zhì)細胞發(fā)生的代謝變化。為此，我們設(shè)計并制造了用于 3D 動態(tài)培養(yǎng)的芯片 A，并刺激細胞向 M1 表型發(fā)展。我們觀察到，與 2D 培養(yǎng)相比，3D 培養(yǎng)中的細胞沒有有效極化。我們得出結(jié)論，成功極化的細胞數(shù)量較少可能不足以改變整體代謝測量。為了證明新型傳感系統(tǒng)在微流體研究中的優(yōu)勢，我們專注于更傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)，并與文獻討論了結(jié)果。因此，我們決定在微流控芯片內(nèi)進行二維動態(tài)單層培養(yǎng)。這些結(jié)果也促使我們將微流控芯片 A 改為芯片 B。經(jīng)過 24 小時的刺激，我們通過 qPCR 分析確保 M1 極化的成功。典型 M1 狀態(tài)標志物 TNFα、IL-6 和 iNOS 的 mRNA 表達水平顯著高于對照組。接下來，我們展示了受刺激的細胞實際上完成了從 mRNA 到蛋白質(zhì)水平的翻譯過程。為此，我們通過執(zhí)行 ELISA 測定了微流控芯片出口處分泌的 TNFα 蛋白的水平。
pH 變化與文獻一致：在之前的幾項研究中，M1 極化已被證明會導致 pH 水平降低，因為受刺激的細胞具有更高的 ECAR。在我們的研究中，與對照芯片相比，我們能夠觀察到 LPS 刺激芯片內(nèi)的 pH 值要低得多。但是當我們查看芯片的初始 pH 值時，它們是不同的。這可能是由于微通道內(nèi)的氣泡形成。氣泡會影響芯片介質(zhì)內(nèi)的溶解氣體濃度，而溶解氣體會改變介質(zhì)的 pH 值。CO 2通過降低 pH 值來影響介質(zhì)，另一方面，如果介質(zhì)暴露于富含氧氣的氣體中，則介質(zhì)的 pH 值會增加。如果對照介質(zhì)暴露于 O 2豐富的氣泡，這可以解釋較高的 pH 值。這種差異還有另一種可能性。設(shè)置實驗和開始測量大約需要 40 分鐘。在測量開始之前將細胞暴露于刺激因子。這可能是由于 LPS 刺激的細胞在刺激后通過 iNOS 的形成降低了培養(yǎng)基的 pH 值[7]。
O 2水平與文獻不符：N9 小膠質(zhì)細胞的 LPS 刺激降低了增殖率并改變了細胞代謝，使其成為糖酵解依賴性。細胞代謝的這些變化導致耗氧量降低，并且由于細胞周期停滯 [9] 與相對較低的細胞數(shù)量相結(jié)合，LPS 刺激細胞的溶解氧水平測量值預計將高于對照，并且必須具有增加的趨勢24小時刺激。我們的結(jié)果顯示 LPS 刺激細胞的氧水平降低了 7%。必須進行更多的實驗以更好地理解為什么會出現(xiàn)這種與文獻的分歧。
